在我國常采用大曲、小曲和麩曲生產(chǎn)白酒，固態(tài)發(fā)酵 生產(chǎn)白酒方法中，大曲既是一種粗制酶制劑，又是一種糖 化發(fā)酵劑，同時(shí)也起生香作用。由于大曲是自然培養(yǎng)而 成的，所以含有霉菌、酵母、細(xì)菌等多種微生物種群及其產(chǎn) 生的蛋白酶酶系、淀粉酶酶系及風(fēng)味酶酶系等復(fù)合酶系， 是一種多菌種的混合酶制劑，為形成復(fù)雜的香氣成分起 重要作用，由此可見，曲的優(yōu)劣與酒的質(zhì)量和酒體風(fēng)格直 接相關(guān)，名酒之所以為名酒，名在質(zhì)量，貴在風(fēng)格。微生物 在白酒釀造中起著主要作用，因此了解微生物在酒曲培養(yǎng)以及白酒釀造過程中的習(xí)性和作用，不僅有利于提高白酒 質(zhì)量，而且可滿足消費(fèi)者對于曲酒類型的不同需求以及對 曲酒品質(zhì)的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型白酒中高溫曲（1月齡、2月齡、4月齡，分別命名 為Z1、Z2、Z3）、芝麻香型白酒高溫曲（命名為AA1）：均取 自河南省宋河酒業(yè)股份有限公司。樣品采集后迅速粉碎密 封，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?br />
1.1.2 主要試劑

Taq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合 酶（5 U/μL）：美國Thermo公司；E.Z.N.A.Soil DNA提取試 劑盒：美國OMEGA公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒： 生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit2.0 DNA檢測試 劑盒：美國Life公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler PCR儀：德國Eppendorf公司；Pico-21臺式 離心機(jī)：美國Thermo Fisher公司；其林貝爾GL-88B漩渦混合器：其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器： 拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠； GelDoc-ItTS3凝膠成像系統(tǒng)：美國UVP公司；Miseq高通量 測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

酒曲中微生物總DNA的提取按照DNA提取試劑盒說 明書中的方法和步驟進(jìn)行。

1.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及測序

以總DNA為模板，采用Miseq測序平臺的通用引物 ITS1（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode） CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2-Rev（5'-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對酒曲中真菌的ITS序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三 磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）0.1 mmol/L， DNA 10 ng，ITS1 0.5 μmol/L，ITS2-Rev 0.5 μmol/L，Plantium Taq 0.05 U，用雙蒸水補(bǔ)充至50 μL。 PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃ 退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計(jì)5個(gè)循環(huán)；然后94 ℃變性20 s， 45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計(jì)20個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延 伸5 min。 PCR擴(kuò)增結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，利用 SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。利用 Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確 定量，依托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

將測序獲取的原始序列的雙末端序列融合成一個(gè)方 向的序列并進(jìn)行質(zhì)量控制（quality control，QC），方法如下：
（1）序列的融合，采用1.2.3 Flash軟件融合雙末端的序 列，通過各個(gè)樣品的barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，并對各個(gè)樣 品序列進(jìn)行質(zhì)量控制。
（2）QC分析：采用V0.20.4 Prinseq軟件對序列閱讀框的 3'端進(jìn)行質(zhì)控，去掉堿基質(zhì)量（Q）值＜20的數(shù)據(jù)，提高后續(xù) 序列的融合比率；通過Flash軟件融合雙末端序列，使其形 成一條序列；采用Prinseq軟件去除各個(gè)樣品的引物序列、小 于200 bp的序列、低質(zhì)量序列和低復(fù)雜度序列；截掉非靶區(qū) 域序列和嵌合體，首先采用1.30.1 Mothur軟件的Pre. cluster 模塊校正測序錯(cuò)誤，校正過程中允許的最大錯(cuò)配是1/150。 然后，以Silva數(shù)據(jù)庫中的序列作為模板，采用Uchime功能 模塊去掉嵌合體和非靶區(qū)域序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列的拼接

采用Illumina Miseq測序平臺得到Z1、Z2、Z3、AA1樣 本對應(yīng)的原始序列分別為49 404條、51 278條、64 658條和 98 202條，其平均長度分別為317.72 bp、304.71 bp、296.31 bp 和254.15 bp，經(jīng)拼接、過濾，分別得到有效序列49 389條、 51 246條、64 587條和97 934條，其平均長度分別為273.91 bp、 261.13 bp 、252.28 bp和211.03 bp。

2.2 序列豐富度和多樣性分析

香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)、辛普森 （Simpson）指數(shù)和Coverage指數(shù)是常用于描述微生物群落 物種多樣性的Alpha多樣性指數(shù)，這5個(gè)多樣性指數(shù)可以對 群落物種組成的豐富度及群落物種組成的均勻度進(jìn)行綜 合性的評價(jià)，5個(gè)多樣性指數(shù)中的Shannon指數(shù)對微生物群 落物種多樣性更為敏感。其中，Shannon指數(shù)越大，群落物 種的多樣性越高；Chaol指數(shù)或ACE指數(shù)越大表明群落物 種豐富度越高；由Coverage指數(shù)可知本次實(shí)驗(yàn)的取樣是否 合理，若Coverage指數(shù)＞97%，則證明本次取樣是合理的；但Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低?；诟咄?量測序技術(shù)對濃香型白酒中高溫曲和芝麻香型白酒高溫 曲中真菌的序列數(shù)量、操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）和Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果見表1。

對數(shù)值上略有差異，但都可以看出測序數(shù)據(jù)量已足 夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。通過對4個(gè) 樣本對比分析可知，在濃香型白酒中高溫曲中，樣品Z3的 Chao1指數(shù)值（668.43）最大，說明Z3樣本的真菌群落物種豐 富度最高；樣品Z2的Shannon指數(shù)值（1.42）最大且Simpson 指數(shù)值（0.36）最小，說明樣品Z2的真菌群落多樣性最高。 芝麻香型白酒高溫曲樣本AA1的Chao1指數(shù)值（764.45）和 Shannon指數(shù)值（2.65）都比濃香型白酒中高溫曲的指數(shù)值 大，因此，芝麻香型高溫曲的真菌物種豐富度和真菌群落 多樣性都比濃香型白酒中高溫曲的大。4個(gè)樣品的Coverage 指數(shù)都＞97%，說明本次取樣是合理的，測序結(jié)果能反映 樣本的真實(shí)情況。

2.3 香農(nóng)指數(shù)曲線分析

香農(nóng)指數(shù)曲線反映樣品中微生物多樣性，可以用于比 較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用于說 明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明 測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU， 反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于Illumina MiSeq高通量測序研究了宋河酒 業(yè)濃香型白酒中高溫酒曲和芝麻香型白酒高溫酒曲中的 真菌群落結(jié)構(gòu)。在屬的分類水平上分析，濃香型白酒中高 溫酒曲的優(yōu)勢真菌群（相對豐度≥1%）主要有假絲酵母 （Candida）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、根毛霉屬（Rhizomucor）等。芝麻香型白酒高溫酒曲的優(yōu)勢真菌群主要有 假絲酵母（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、威克漢姆酵母 （Wickerhamomyces）等。隨著濃香型白酒中高溫酒曲貯存 時(shí)間的延長，假絲酵母（Candida）的相對豐度逐漸增加，其 在兩種酒曲中都是優(yōu)勢真菌，此屬中有許多種具有酒精發(fā) 酵的能力。采用高通量測序技術(shù)對酒曲中的菌落物種分類 研究，操作簡單、通量高、信息豐富，和傳統(tǒng)方法比較具有 一定的優(yōu)越性。該研究成果為進(jìn)一步研究優(yōu)化制曲工藝、 提高酒曲質(zhì)量指明了方向，具有重要的理論和實(shí)踐意義。



 

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