激 素 性 股 骨 頭 缺 血 性 壞 死（steroid induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）是由 于糖皮質(zhì)激素大量使用導(dǎo)致骨內(nèi)循環(huán)障礙、骨代 謝失衡、破骨細(xì)胞增多而成骨細(xì)胞凋亡，破壞股 骨頭局部血運(yùn)，引起缺血、壞死，繼而導(dǎo)致股骨 頭塌陷、骨折的一種骨疾病。近年來(lái)，由于糖皮 質(zhì)激素在臨床治療中的濫用，SANFH的發(fā)病率日 漸增高，占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首位，起病隱 襲，病情發(fā)展較快，致殘性強(qiáng)，已成為困擾醫(yī)患 的重大公共難題之一 。本院院內(nèi)制劑川骨片對(duì) SANFH有顯著臨床療效，但其機(jī)制尚不明確。分 裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一類絲氨酸/蘇氨酸 激酶，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、炎癥反應(yīng)等具有調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性日本大耳兔 56 只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中 心提供（許可證號(hào)：川實(shí)動(dòng)管第99011號(hào)），檢疫合格備用。本研究動(dòng)物飼養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成，室內(nèi)保持恒定溫度及濕 度，相對(duì)濕度為45%～60%。

1. 2 實(shí)驗(yàn)藥物及制備

川骨片，由續(xù)斷、骨碎 補(bǔ)、黃芪、淫羊藿、肉蓯蓉、熟地、丹參、菟絲 子、枸杞、補(bǔ)骨脂、杜仲、當(dāng)歸、牛膝、乳香、 沒(méi)藥、紅花、獨(dú)活、威靈仙、白術(shù)、茯苓、甘草 等組成，由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生產(chǎn)，批準(zhǔn) 文號(hào)：川藥制字 Z20070657。仙靈骨葆膠囊（貴州 同濟(jì)堂制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字 Z20025337），主要由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知 母、補(bǔ)骨脂、地黃等組成，研究已證明本品能抑 制破骨細(xì)胞的吸收活動(dòng)，加快骨再建活動(dòng)，刺激 骨形成，提高骨密度，是臨床上用于股骨頭壞死 治療的有效制劑，本實(shí)驗(yàn)中作為陽(yáng)性對(duì)照藥物進(jìn)行 研究。將川骨片（規(guī)格：0.3 g/片）使用蒸餾水熬制 為水劑，制備為生藥量0.6 g/mL混懸液體。將仙靈 骨葆膠囊（規(guī)格：0.5 g/粒）用蒸餾水熬制為水劑， 制備為含成藥仙靈骨葆膠囊0.6 g/mL 的混懸藥液。 藥液均于0 ~ 4 ℃保存?zhèn)溆?。以上藥液制備委托?都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制藥車間完成。醋酸潑尼 松龍（華中藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：5 mL∶0.125 g， 生產(chǎn)批號(hào)：20171203）。

1. 3 主要試劑與儀器

p-ERK1/2、p-JNK 和 p-p38 抗體（美國(guó) CST 公司）； GAPDH（武漢普健生物公司）。BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、RIPA lysis buffer （上海碧云天公司）；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰 胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒（武漢普健生物公 司）； 蛋 白 預(yù) 染 marker（美 國(guó) Thermo Scientific公司）。TVO.63XC-MO HE染色成像系統(tǒng) （廣州明美公司）；PP1152電泳儀（上海CAVOY 公 司）；EPS600C 電轉(zhuǎn)儀（上海天能公司）；TS-8S 脫色搖床（江蘇其林貝爾公司）；ChemiDocTM XRS+凝 膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；PerkinElmer全功 能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)PerkinElmer公司）。

1. 4 分組與造模

將56只雄性大耳兔隨機(jī)分成2 組，即空白組（16只）和造模組（40只）。適應(yīng)性喂 養(yǎng)1周后，造模組采用賀西京造模法復(fù)制SANFH模 型：于兔右側(cè)臀部肌肉注射醋酸潑尼松龍8 mg/kg， 每周2次，連續(xù)注射6周。空白組右側(cè)臀肌注射等 量生理鹽水，每周2次，連續(xù)注射6周。所有動(dòng)物 左側(cè)臀肌預(yù)防性注射青霉素8萬(wàn)U/kg，預(yù)防感染， 每周2次，共6周。6周后處死空白組4只和模型組 4 只進(jìn)行模型鑒定。在無(wú)菌條件下取出右側(cè)股骨 頭，采用蘇木素—伊紅（HE）染色，于光鏡下觀察 骨小梁、骨細(xì)胞、髓腔及造血細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和 數(shù)量的變化，并在股骨頭軟骨下區(qū)骨組織上隨機(jī) 選擇10個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野中所有骨陷窩 數(shù)和空骨陷窩數(shù)，計(jì)算出空骨陷窩率，判斷造模 是否成功?？展窍莞C率=空骨陷窩數(shù)/全部骨陷窩 數(shù) × 100%。

1. 5 給藥方法

造模成功后剩余的36只造模組兔 再隨機(jī)分為模型對(duì)照組、川骨片治療組、仙靈骨 葆膠囊治療組，每組12只。按成人60 kg體質(zhì)量換 算法換算，川骨片治療組給予川骨片（劑量為0.6 g·kg-1 ·d-1 ）灌胃，仙靈骨葆膠囊治療組給予仙靈骨 葆膠囊（劑量為0.6 g·kg-1 ·d-1 ）灌胃，模型對(duì)照組給 予蒸餾水1 mL/kg灌胃，空白組不做任何處理，連 續(xù)灌胃42 d。

1. 6 觀察指標(biāo)與方法

1. 6. 1 取材

采用空氣栓塞法處死各組家兔，在 無(wú)菌條件下取出家兔右側(cè)股骨，取下股骨頭冠狀 面剖開分別置于 40 g/L 多聚甲醛、液氮中保存?zhèn)?用。

1. 6. 2 光鏡觀察股骨頭組織形態(tài)

將組織放入配 好的混合酸脫鈣液中進(jìn)行脫鈣，脫水機(jī)內(nèi)依次梯 度酒精進(jìn)行脫水，浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋，石蠟切片機(jī)切片，片厚4 μm，HE染色，樹 膠封片供鏡檢。

1. 6. 3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)股骨頭

組織 p-ERK1/2、p-JNK 和 p-p38 蛋白表達(dá) 將組 織剪碎，加入配制好的RIPA裂解液中，然后進(jìn)行 離心等處理，用 BCA 試劑盒檢測(cè)總蛋白含量。 12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，一抗（pERK1/2 1∶2 000 稀釋，p- JNK 1∶1 000 稀釋，pp38 1∶1 000 稀釋，GAPDH 1∶5 000 稀釋）4 ℃過(guò)夜 孵育，室溫二抗孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯 影，洗片。膠片經(jīng)掃描儀掃描后獲得圖像。用 Image J軟件計(jì)算目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH蛋白 條帶的灰度比值（p）。

1. 7 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù) 分析，計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（- x ± s）表示，組間 比較用單因素方差分析，股骨空骨陷窩率（p/%）組 間比較采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。

2 結(jié)果

2. 1 家兔股骨頭光鏡鏡檢結(jié)果

空白組：軟骨細(xì) 胞以及骨細(xì)胞基質(zhì)紅染，染色均勻，軟骨細(xì)胞排 列規(guī)則整齊，組織結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，潮線完整。股 骨頭部骨小梁完整無(wú)明顯變形、斷裂，排列規(guī) 則，骨組織內(nèi)可見(jiàn)大量活躍的成骨細(xì)胞，骨陷窩 稀少，滋養(yǎng)血管豐富，髓腔內(nèi)可見(jiàn)大量形態(tài)規(guī)則 的造血細(xì)胞，整個(gè)組織的結(jié)構(gòu)完整，其中僅可見(jiàn) 極少的脂肪細(xì)胞。模型對(duì)照組：軟骨細(xì)胞破壞明 顯，細(xì)胞變形，不規(guī)則，整個(gè)軟骨層組織排列粗 糙不平整，可見(jiàn)較寬的細(xì)胞間隙直達(dá)深層組織， 部分動(dòng)物可見(jiàn)股骨頭軟骨細(xì)胞完全剝離，軟骨組 織結(jié)構(gòu)模糊不清，潮線明顯中斷。骨組織的骨小 梁變細(xì)，稀疏，排列不規(guī)則，結(jié)構(gòu)紊亂，骨小梁 之間的間距增寬，骨髓內(nèi)中可見(jiàn)大量分布的脂肪 細(xì)胞，而骨細(xì)胞則變形萎縮，在組織邊緣聚集， 組織內(nèi)可見(jiàn)大量骨陷窩存在。川骨片治療組：鏡 下可見(jiàn)關(guān)節(jié)軟骨輕度變性，軟骨表面細(xì)胞排列不 規(guī)則，粗糙不整，軟骨下骨組織內(nèi)可見(jiàn)較豐富的 血管分布，骨組織的四層結(jié)構(gòu)基本清晰，潮線不 連續(xù)，鏡下可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞增生，骨小梁較模 型對(duì)照組粗大，骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)造血細(xì)胞散在分布，大部分的骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，骨組織內(nèi)鏡 下可見(jiàn)的空骨陷窩較模型對(duì)照組有所減少。仙靈 骨葆膠囊治療組：鏡下可見(jiàn)關(guān)節(jié)軟骨輕度變性， 軟骨表面細(xì)胞排列不規(guī)則，粗糙不整，軟骨下骨 組織內(nèi)可見(jiàn)較豐富的血管分布，骨組織的四層結(jié)構(gòu)基本清晰，潮線不連續(xù)，鏡下可見(jiàn)少量炎性細(xì) 胞增生，骨小梁較模型對(duì)照組粗大，骨髓腔內(nèi)可 見(jiàn)造血細(xì)胞散在分布，大部分的骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu) 正常，骨組織內(nèi)鏡下可見(jiàn)的空骨陷窩較模型對(duì)照 組有所減少。

2. 2 各組家兔股骨空骨陷窩率比較

造模組家兔股骨空骨陷窩率明顯高于空白組 （P＜0.05）。表明糖皮質(zhì)類激素可以導(dǎo)致骨細(xì)胞的 破壞，導(dǎo)致空骨陷窩率明顯升高。提示實(shí)驗(yàn)前期 造模成功。第 13 周時(shí)，與模型對(duì) 照組比較，川骨片治療組、仙靈骨葆膠囊治療組 的空骨陷窩率明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；川骨片治療組空骨陷窩率與仙靈骨葆膠囊 治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.0.5）。

3 討論

目前，激素性股骨頭缺血性壞死（SANFH）的 發(fā)病機(jī)制仍不明確，存在高凝低纖溶微血管血栓 栓塞學(xué)說(shuō)、脂肪代謝紊亂學(xué)說(shuō)、骨內(nèi)高壓學(xué)說(shuō)、 二次碰撞學(xué)說(shuō)、遺傳以及基因多態(tài)性學(xué)說(shuō)等 。 但股骨頭缺血壞死的發(fā)病機(jī)制更多集中于分子生 物學(xué)水平細(xì)胞增殖、分化、凋亡的研究。MAPK通 路在促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、抑制其凋亡中發(fā)揮重 要作用。ERK1/2、p38、JNK是MAPK家族的主要 成員?；罨?MAPK 通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)將外界信號(hào)傳 遞給細(xì)胞核，通過(guò)作用于 AIF-2、cMyc 等轉(zhuǎn)錄因 子，調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、分化相關(guān)的基因表達(dá)。其 中最早發(fā)現(xiàn)的Ras-Raf-MAPK經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是 ERK1/2 信號(hào)通路，ERK1、ERK2、ERK3、ERK4 和ERK5是它的5個(gè)亞組，其中ERK1和ERK2是2 個(gè)高度同源的亞類，它們的分子質(zhì)量分別是 44 kDa和42 kDa，它們?cè)谠鲋尺^(guò)程中起著重要作用， 卻在分化過(guò)程中作用不明顯。Raf家族屬于促分 裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK），當(dāng)Raf被 激活，其后使 MEK1/2 磷酸化，最終磷酸化激活 ERK1/2。被激活的ERK1/2轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，引起細(xì)胞 生長(zhǎng)、增殖與分化。



 

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