藥物引發(fā)的肝毒性問(wèn)題是終止新藥研發(fā)和導(dǎo)致 藥物退市最主要的因素之一，同時(shí)也是政府監(jiān)管行 為最常見(jiàn)的原因之一。如曲格列酮、非阿尿苷等 均因嚴(yán)重肝毒性而被迫撤回。藥物引起肝損傷的發(fā) 病機(jī)制主要有藥物直接損害、間接損害( 包括細(xì)胞 毒性和膽汁淤積性) 、免疫介導(dǎo)性肝損傷、炎癥反 應(yīng)、線粒體失能以及機(jī)體對(duì)藥物的特異質(zhì)反應(yīng)。在 相關(guān)發(fā)病機(jī)制中，我們對(duì)膽汁淤積性肝毒性知之甚 少，其臨床前預(yù)測(cè)也僅限于評(píng)估藥物抑制膽鹽輸出 泵的能力，缺乏完善的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1 藥品與試劑 

ASP，APAP，Nef，Tol，F(xiàn)A( 美國(guó) Cayman 公司) ; Tro( 美國(guó) ＲD 公司) ; Iso( 美國(guó) Enzo 公司) ; 青霉素、 鏈霉素、胎牛血清、Willams'Medium E 培養(yǎng)基( Gibco 公司) ; 引物合成( Invitrogen 公司) ; TＲNzol 總 ＲNA 提取試劑、DL2，000 DNA Marker ［TaKaＲa( 寶生物) 公司］; 抗體( Abcam 公司) 。 

2 儀器 

ＲT-PCＲ 試劑盒、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒( Qiagen 公司) ; 96 孔板( 美國(guó) Corning 公司) ; CO2 培養(yǎng)箱 ( 美國(guó) ThemoForma 公司) ; CCK8 試劑盒( 日本同仁 化學(xué)研究所) ; 尿素檢測(cè)試劑盒( Abcom 公司) ; QL-902 渦旋振蕩儀( 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公 司) ; Centrifuge 5415D 離 心 機(jī) ( Eppendorf 公 司) ; NANODＲOP 2000 分光光度計(jì)( Therno Scientific 公 司) ; Tanon 1600 凝膠成像系統(tǒng)( 上海天能科技有限 公司) ; ABI7500 熒光定量 PCＲ 儀( Applied Biosystems 公 司) ; ELX 800 酶標(biāo) 儀 ( 美 國(guó) Bio-Tek 公 司) ; HＲ220 掌上離心機(jī)( Servicebio 公司) ; Nikon Eclipse E100 正置熒光顯微鏡( 日本尼康公司) 。 

3 細(xì)胞 

HepG2 細(xì)胞( 本實(shí)驗(yàn)室凍存) ; HepaＲG 細(xì)胞( 美 國(guó) Millipore 公司) 。 4 2D 及 3D 細(xì)胞培養(yǎng) HepaＲG 和 HepG2 細(xì)胞接種于含 10% 胎牛血 清，100 μmL － 1青霉素、100 μg·mL － 1鏈霉素、4 mmol· L － 1 L-谷氨酰胺的 Williams'Medium E 培養(yǎng)基中，于 5% CO2 的 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，達(dá)到 70% ～ 80% 融合時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，PBS 清洗，加胰酶鏡下觀 察細(xì)胞回縮變圓時(shí)終止消化，加少量培養(yǎng)基輕輕吹 打制備細(xì)胞懸液，并傳代。3D 培養(yǎng)條件下，將 HepaＲG 分別以每孔 100，200，400，800，1 600 個(gè)接種于 U 型底低吸附 96 孔板中，于 37 ℃，5% 的 CO2 培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，形成3D 微球結(jié)構(gòu)，可持續(xù)培養(yǎng)28 d，其間 通過(guò)鏡下觀察球體變化并記錄其直徑大小。

通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件成功構(gòu)建了 3D HepaＲG 肝毒性評(píng)價(jià)模型，能夠從一定程度上反映出該 體外模型的優(yōu)勢(shì)，也可以為膽汁淤積性肝損傷的研 究提供一定的借鑒，但論據(jù)尚不充分，在接下來(lái)的研 究中，將利用高內(nèi)涵篩選技術(shù)檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞活 力、代謝凋亡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等各個(gè)環(huán)節(jié)的影響，進(jìn)一步 探明引起藥物肝損傷的毒性機(jī)制，從而為化合物的 安全性預(yù)測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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