銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，具有治 療困難、病情易反復(fù)等特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，大 多認(rèn)為銀屑病的發(fā)病是由多因素導(dǎo)致的，包括遺傳因 素、感染因素、免疫因素和環(huán)境因素等，目前研究發(fā)現(xiàn) 線粒體損傷、氧化應(yīng)激與銀屑病的發(fā)病有著密切的關(guān) 系。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 γ 輔激活子 1α ( peroxisome proliferator － activated receptor － γ coactivator － 1α，PGC － 1α) 是調(diào)節(jié)線粒體生物合成的關(guān)鍵因 子，具有調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈復(fù)合物亞基表達(dá)從而減少 ＲOS 生成和調(diào)控體內(nèi)抗氧化因子從而減少氧化應(yīng)激 的作用。在抗機(jī)體氧化損傷中有重要意義。本研究旨 在通過(guò)研究銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞( PBMC) PBMC 中 PGC － 1α 的表達(dá)從而探討線粒體障礙對(duì)銀 屑病的調(diào)節(jié)機(jī)制與涼血消風(fēng)湯對(duì)銀屑病的治療機(jī)制。

收集2017 年5 月—2017 年12 月至天津市中醫(yī)藥 研究院附屬醫(yī)院皮膚科就診血熱型尋常型銀屑病患 者。血熱型診斷標(biāo)準(zhǔn): 參照《中華人民共和國(guó)中醫(yī)藥 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)皮膚科病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》，主癥: 新 皮損不斷出現(xiàn)，以丘疹、斑丘疹為主，皮損基底皮膚顏 色鮮紅，刮去鱗屑有點(diǎn)狀出血，有同形反應(yīng)。次癥: 初 發(fā)或復(fù)發(fā)，可有不同程度的瘙癢、心煩、口渴或口干、便 秘、尿黃、舌質(zhì)紅、苔黃、脈數(shù)。具備以上主癥及次癥 2 項(xiàng)以上者即可診斷。

1. 2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合尋常型銀屑病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，10 ＜ PASI 評(píng)分 ＜ 30，處于銀屑病進(jìn)行期;

②符合血熱證 診斷標(biāo)準(zhǔn); ③年齡 10 ～ 70 歲; ④身心健康，無(wú)內(nèi)科嚴(yán)重 心、肝、腎疾病，血尿便常規(guī)、肝腎功能及其它生化指標(biāo) 正常并簽署知情同意書。

① 妊娠、哺乳期、 孕婦或 1 年內(nèi)計(jì)劃妊娠者;

② 并有嚴(yán)重心、肝、腎疾 患、惡性腫瘤患者; 有嚴(yán)重感染、水電解質(zhì)及酸堿平衡 紊亂者;

③其他證型銀屑病，如血瘀型銀屑病、血燥型 銀屑病。剔除標(biāo)準(zhǔn): 納入后發(fā)現(xiàn)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，或未 按本治療方案規(guī)范實(shí)施的病例，需予別除，其結(jié)果不計(jì) 入最終統(tǒng)計(jì)分析。

① 不按時(shí)服用藥物、復(fù) 診或自行退出;

② 患者病情加重需使用其他藥物應(yīng)急 處理者。

中藥組收集 18 例，脫落 4 例。其中男 6 例，女 8 例; 年齡最小 14 歲，最大 63 歲，平均( 37. 64 ± 13. 73) 歲。正常對(duì)照組收集 14 例健康人。其中，男 4 例，女 10 例; 年 齡 最 小 21 歲，最 大 65 歲，平 均 ( 40. 71 ± 12. 90) 歲。正常對(duì)照組選取年齡、性別與中藥組相匹配的健康人來(lái)源于本院體檢人群，經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)， 所有受試者均簽署之情同意書。

Annexin V － FITC /PI apoptosis kit ( 聯(lián) 科 生 物) ; PPAＲ GCIA antibody ( Sangon Biotech) ; Actin antibody ( Abcam) ; Goat Anti － Ｒabbit IgG，HＲP ( Sangon Biotech) ; ＲIPA 裂解液( 碧云天) ; Western blot 封閉液( BD 脫脂 奶 粉 配 制) ; PVDF 膜 ( Millipore ) ; BSA 緩 沖 液 ( Amresco) ; 30% 丙 烯 酰 胺 ( Amresco ) ; 流 式 細(xì) 胞 儀 ( BD) ; 雙垂直電泳槽( CAVOY) ; 溫控?fù)u床( 其林貝爾) ; 電泳儀( CAVOY) 。

收集約 1 × 106 ～ 3 × 106 個(gè)細(xì) 胞，加 入 500μL Apoptosis Positive Control Solution 重 懸，置冰上孵育 30min 加入適量預(yù)冷 1 × Binding Buffer 重懸，并加入數(shù)量相同且未經(jīng)處理的活細(xì)胞與之混合。 加入預(yù)冷 1 × Binding Buffer 補(bǔ)充至 1. 5 mL，等分成 3 管，其中一管為空白對(duì)照管、兩管為單染管。單染管分 別加入 5μL Annexin V － FITC 或 10μL PI，流式細(xì)胞儀 上，用空白管調(diào)節(jié) FSC、SSC 和熒光通道的電壓，并在 此電壓條件下，用單染管調(diào)節(jié)熒光通道的補(bǔ)償。

離心收集 1 ～ 5 × 105 個(gè)細(xì)胞，用雙 蒸水稀釋 5 × Binding Buffer 為 1 × Binding Buffer，取 500μL 1 × Binding Buffer 重懸細(xì)胞。每管加 入 5μL Annexin V － FITC 和 10μL PI 室溫避光孵育 5min。在 流式細(xì)胞儀上，通過(guò) FITC 檢測(cè)通道檢測(cè) Annexin V － FITC 和通過(guò) PE 檢測(cè)通道檢測(cè) PI。

①提取細(xì)胞總蛋白: 使用酶標(biāo)儀進(jìn) 行蛋白定量，根據(jù) SDS － PAGE 上樣量需要，取適量樣 品加入 4 × loading buffer 后，100℃ 煮沸變性 5min;

② SDS － PAGE 電泳: 根據(jù)目的蛋白的分子量，配制 10% 分離膠凝膠，濃縮膠濃度為 4% 。待檢測(cè)蛋白樣品上樣量為 10 μL。濃縮膠恒壓 80V，約 40 min; 分離膠恒 壓 120V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部;

③轉(zhuǎn)膜: 采用濕轉(zhuǎn) 法，轉(zhuǎn)膜條件為 300 mA 恒流與 0. 45 μmPVDF 膜。冰 浴轉(zhuǎn)膜時(shí)間 2h。轉(zhuǎn)膜完成后用麗春紅染色試劑對(duì)膜 進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。設(shè)置恒流 300 mA，冰浴轉(zhuǎn) 膜 2 h。

中藥組治療前與正常組 PBMC 凋亡比例用成組 t 檢驗(yàn)，結(jié)果 P = 0. 014( P ＜ 0. 05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義) 。 治療前與治療后 PBMC 凋亡比例用配對(duì) t 檢驗(yàn)，結(jié)果 P = 0. 043( P ＜ 0. 05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義) ，說(shuō)明銀屑病 病人 PBMC 凋亡率高于正常人，經(jīng)涼血消風(fēng)湯治療后 病人凋亡率明顯下降，銀屑病治療前 PGC － 1α 蛋白表達(dá)較正常組下調(diào)， P = 0. 029( P ＜ 0. 05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義) ，經(jīng)中藥治療 后 PGC － 1α 蛋白表達(dá)較治療前上調(diào)，P = 0. 00 ( P ＜ 0. 01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義) 。說(shuō)明涼血消風(fēng)湯治療有效。

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所，其主要 功能單位為位于線粒體內(nèi)膜上的線粒體呼吸鏈。線粒體呼吸鏈由五個(gè)復(fù)合物構(gòu)成，它們不但是 ATP 的主要 來(lái)源，也是 ＲOS 產(chǎn)生的主要場(chǎng)所。生理狀態(tài)下，呼 吸鏈在傳遞電子過(guò)程中會(huì)有 2% 的電子逃逸，與氧氣 反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子( O  2 ) ，O  2 部分還原生成過(guò)氧化 氫( H2O2 ) ，又進(jìn)一步還原成羥自由基( ·OH) ，這些不 穩(wěn)定的自由基統(tǒng)稱為活性氧( ＲOS) 。一定濃度的 ＲOS 可參與細(xì)胞增殖、凋亡和 Ca 2 + 儲(chǔ)存等生理過(guò)程， 是細(xì)胞正常生命活動(dòng)所必須的。線粒體呼吸鏈可以不 斷產(chǎn)生 ＲOS，而線粒體中存在許多的抗氧化酶，谷胱 甘肽過(guò)氧化物酶( GSH － Px) 等可以清除由活性氧和 ·OH 誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化物，使 ＲOS 維持在較低生理 水平。若線粒體功能障礙則會(huì)出現(xiàn) ＲOS 生成的增 多和抗氧化因子生成減少，從而使體內(nèi)的抗氧化防御 系統(tǒng)遭到破壞，大量 ＲOS 在體內(nèi)蓄積，破壞脂質(zhì)、蛋白 質(zhì)、DNA 的結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生。細(xì)胞凋亡主要有兩大經(jīng)典途徑，即以線粒體為中 心的內(nèi)源性凋亡途徑，以及由死亡受體介導(dǎo)的外源性 凋亡途徑。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，線粒體功能障礙起 源的凋亡途徑在凋亡發(fā)生過(guò)程中起核心作用。過(guò)多 的 ＲOS 可以引起構(gòu)成線粒體內(nèi)膜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)損 傷，促使線粒體內(nèi)膜流動(dòng)性和通透性改變，通透性轉(zhuǎn)換 孔( m PTP) 開啟。m PTP 開啟可改變線粒體膜電位和 滲透壓，使線粒體發(fā)生腫脹，線粒體呼吸鏈功能減弱， 甚至使線粒體膜破裂。細(xì)胞色素 C 從線粒體釋放標(biāo) 志著細(xì)胞凋亡的開始，線粒體膜通透性增加后細(xì)胞 色素 C 被釋放到細(xì)胞質(zhì)中激活 caspase 家族并誘導(dǎo) caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終使 caspase3 激活。而活化的 caspase3 可使多聚 ADP － 核糖聚合酶中與 DNA 結(jié)合 的 2 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端的催化區(qū)域分離，從而引起 細(xì)胞凋亡。





 

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