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淺談皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制分析

返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-09-27 10:55【

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種 成分,細(xì)菌裂解后進(jìn)入宿主體內(nèi),能引起內(nèi)毒素血 癥,刺激機(jī)體炎癥因子的產(chǎn)生增加,產(chǎn)生局部或系 統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。大鼠腸隱窩上皮細(xì)胞(intestial epithelial cell line,IEC-6),為腸黏膜屏障的組成部 分,LPS 可誘導(dǎo) IEC-6 細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng),炎癥介 質(zhì)引起緊密連接(TJ)復(fù)合物結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架和細(xì)胞通 透性的改變,這種炎癥反應(yīng)的發(fā)生將損害腸黏膜的 屏障功能 。

1 材料與方法

1.1 動物

SD 大鼠(230~270 g),SPF 級,雄性,購 于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗動物有限公司,許可證號: SCXK(湘)2016-0002。

1.2 細(xì)胞株

IEC-6 細(xì)胞,購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.3 藥物及試劑

參苓白術(shù)散,北京漢典制藥有限公 司,批號:Z20040146;脂多糖(LPS),美國 Sigma 公司產(chǎn)品,批號:025M4040V;TRIzol Reagent,北 京全式金公司,批號:K10526;MTT 細(xì)胞增殖試劑 盒,南京凱基生物有限公司,批號:20161229;IL8 ELISA 試劑盒,欣博盛生物科技有限公司,批號: ERC008;mcherry-GFP-LC3 雙標(biāo)腺病毒,漢恒生物 科技(上海)有限公司,批號:AP07071804;兩步 RT-PCR 試劑盒(批號:AE301)、100bp Plus DNA Ladder(批號:K20415),北京全式金公司;瓊脂糖 (Agarose), Genview 公 司 , 批 號 : 2B180205600; GoldView I 型核酸染料(批號:41230)、50×TAE 電泳液(批號:20141021),北京索萊寶公司; GAPDH、 ATG5、 ATG12、 ATG13、 ATG1611、 ATG1612 引 物,生工生物工程(上海)有限公司。

1.4 儀器

I 類 B 型醫(yī)用超凈工作臺,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;MCO175 型細(xì)胞培養(yǎng)箱,日本 SANYO 公司;S40-SLIDER 倒置普通光學(xué)顯微鏡、 DMI3000B 型熒光倒置顯微鏡,德國 Leica 公司; Elx800 型酶標(biāo)儀,美國 BioTek 公司;PCR 儀,德國 Eppendorf 公司。

2 結(jié)果

當(dāng) LPS 濃度達(dá)到 100 μg · mL-1 時,細(xì)胞活力值 與空白組比較開始出現(xiàn)明顯差異(P < 0.05),該濃度 下細(xì)胞抑制率為 29.3 %,因此選用 100 μg · mL-1 的 LPS 濃度為后期 IEC-6 細(xì)胞炎癥模型的造模濃度。與對照組比較,不 同濃度含量的參苓白術(shù)散含藥血清對 IEC-6 細(xì)胞活 力均無明顯作用(P > 0.05)。mRFP -GFP -LC3 腺病毒滴 度為 1010 pf μ·mL-1 。從圖 4 可以看出,加入濃度梯 度為每孔 0.1、0.2、0.4、0.8 μL 的 mcherry- GFPLC3 腺病毒轉(zhuǎn)染 IEC-6 細(xì)胞,腺病毒轉(zhuǎn)染率和熒光 強(qiáng)度隨腺病毒濃度的加大而增強(qiáng)。每孔加入 0.4 μL 腺病毒時 IEC-6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率高,熒光強(qiáng)度最強(qiáng),且 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)較 0.8 μL 腺病毒組正常,故 選取每孔加入 0.4 μL mRFP-GFP-LC3 腺病毒量作為 感染 IEC-6 細(xì)胞正式實(shí)驗的濃度。與空白組比 較,模型組中自噬體斑點(diǎn)形成明顯減少或消失(P < 0.05);與模型組比較,參苓白術(shù)散含藥血清組、自 噬誘導(dǎo)劑 Rapamycin 組的自噬斑點(diǎn)形成明顯增加,自 噬活力增強(qiáng)(P < 0.05);自噬抑制劑 3-MA 組與模型 組比沒有差別,自噬斑點(diǎn)稀少(P < 0.05)。結(jié)果表明 參苓白術(shù)散能促進(jìn)損傷的 IEC-6 細(xì)胞發(fā)生自噬。

3 討論

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種以細(xì)胞質(zhì)空泡自噬化為特征的溶酶體依賴性降解途徑,實(shí)現(xiàn)細(xì) 胞本身代謝需要和某些細(xì)胞器更新,主要與細(xì)胞的 存活、分化、發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持密切相關(guān), 在維持腸黏膜免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,細(xì)胞 自噬同樣發(fā)揮著重要作用。近期研究也證實(shí)在腸上 皮細(xì)胞中,自噬基因 ATG16L1 可負(fù)性調(diào)控 IL-1β 誘 導(dǎo)的炎癥因子表達(dá) ,任彩瑗等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬可通 過調(diào)控 NF-κB 分子信號通路抑制 LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

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