真菌毒素(mycotoxins)也叫霉菌毒素,是產(chǎn)毒 真菌在適宜環(huán)境條件下的次級代謝產(chǎn)物,具有生物 毒性。截至目前已分離得到 100 多種真菌,可產(chǎn)生 大約 300 種有毒的次級代謝產(chǎn)物。農(nóng)產(chǎn)品中常見 的真菌毒素有黃曲霉毒素(aflatoxin)、赭曲霉毒素 (ochratoxin)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)、伏馬 毒素(fumonisin)、雜色曲霉素(sterigmatocystin)、 單端孢霉烯族毒素(trichothecenes)以及橘青霉素 (citrinin)等。糧谷類農(nóng)作物在種植過程中和貯藏 期間容易受到真菌的侵染,導(dǎo)致真菌毒素污染情況 普遍存在。由于近年來受全球氣候變暖、干旱等 因素的影響,世界各國真菌毒素暴露事件屢見不鮮, 特別是糧谷產(chǎn)品中多種真菌毒素混合污染現(xiàn)象頻頻發(fā)生,真菌毒素多殘留檢測受到越來越多的關(guān) 注和重視。
1 實驗部分
1.1 儀器、試劑與材料
四 極 桿/ 靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 Q- Exactive、UltiMate 3000 高效液相色譜儀,Thermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2. 1 mm,1. 9 μm) (美 國 Thermo Fisher Scientific 公 司);Captiva EMR-Lipid 凈 化 柱 (3 mL,美 國 Agilent 公 司); 3K15 離心機(德國 Sigma 公司);DL-5C 低速大容 量離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);OA-SYS 氮吹儀 (美國 Organomation 公司);Milli-Q 超純水純化系統(tǒng) (美國 Millipore 公司);渦旋混合器(德國 IKA 公司)。 黃曲霉毒素 B1 標準品溶液(aflatoxin-B1,質(zhì)量 濃度為 2. 0 mg / L)、黃 曲 霉 毒 素 B2 標 準 品 溶 液 (aflatoxin-B2,質(zhì)量濃度為 0. 5 mg / L)、黃曲霉毒素 G1 標 準 品 溶 液 (aflatoxin-G1,質(zhì) 量 濃 度 為 2. 0 mg / L)、黃曲霉毒素 G2 標準品溶液(aflatoxin-G2, 質(zhì)量濃度為 0. 5 mg / L)購自美國 Trilogy 公司;黃曲 霉毒素 M1(aflatoxin M1,純度為 99. 8%)、脫氧雪腐 鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,純度為 99. 6%)、3-乙?;撗跹└牭毒┐?(3-acetyl deoxyni- valenol,純度為 99. 0%)、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌 烯醇(15-acetyl deoxynivalenol,純度為 99. 0%)、赭 曲霉毒素 A(ochratoxin-A,純度為 99. 9%)、黃曲霉 毒素 M2(aflatoxin M2,純度為 99. 0%)、玉米赤霉烯 酮(zearalenone,純度為 99. 0%)、黃綠青霉素(cit- reoviridin,純 度 為 98. 0%)、蛇 形 菌 素 (diacetoxy- scirpenol,純度為 98. 0%)、伏馬毒素 B1 標準品溶液 (fumonisin B1,質(zhì)量濃度為 99. 7 mg / L)、伏馬毒素 B2 標 準 品 溶 液 (fumonisin B2,質(zhì) 量 濃 度 為 100 mg / L)、伏馬毒素 B3 標準品溶液(fumonisin B3,質(zhì) 量濃度為 100 mg / L)、HT-2 毒素(HT-2 toxin,純度 為 99. 0%)、T-2 毒素(T-2 toxin,純度為98. 0%)、雜色 曲霉素(sterigmatocystin,純度為 99. 2%)均購自美 國 Achemtek 公司,桔青霉素標準品溶液(citrinin,質(zhì) 量濃度為 10 g / L)購自以色列 Fermentek 公司。 乙腈和甲醇(色譜純,德國 Merck 公司);甲酸 (色譜純,美國 Dikma 公司);甲酸銨(色譜純,上海麥克林公司);無水硫酸鎂和氯化鈉(優(yōu)級純,天津 科密歐公司)。
1.2 樣品前處理
準確稱取 5. 00 g 樣品于 50 mL 聚丙烯具塞離 心管中,加入 10 mL 水,渦旋混勻,再加入 10 mL 乙 腈(含 2% 甲酸)、4 g 硫酸鎂和 1. 5 g 氯化鈉,振蕩提 取 10 min,在 4 ℃條件下,以 5 000 r / min 的速度離 心 5 min,移出 8 mL 上層乙腈相,加入 2 mL 水,渦 旋混合。取 3 mL 萃取液上樣到 Captiva EMR-Lipid 凈化柱,使其在重力作用下流過凈化柱并收集凈化 液,待萃取液完全流過后,加壓排空凈化柱。取 2. 5 mL 凈 化 液 于 40 ℃ 水浴中氮吹至近干,用 5 mmol / L 甲酸銨(含 0. 1% 甲酸)-乙腈溶液(5 ∶ 5, v / v)定容至 1 mL,充分混勻后,過 0. 22 μm 有機相 濾膜,進樣分析。
1.3 色譜-質(zhì)譜條件
Thermo Hypersil Gold C18 柱(100 mm × 2. 1 mm,1. 9 μm);柱溫:40 ℃;進樣量:10 μL。流動 相:A 為 5 mmol / L 甲酸銨水溶液,B 為乙腈-甲醇 (1 ∶1,v / v);流速:0. 35 mL / min。梯度洗脫條件:0 ~ 0. 8 min,2% B;0. 8~3. 0 min,2% ~24% B;3. 0~ 4. 0 min,24% B;4. 0 ~ 6. 0 min,24% ~ 95% B;6. 0 ~9. 0 min,95% B;9. 0 ~ 9. 5 min,95% B ~ 2% B; 9. 5~12. 0 min,2% B。
2 結(jié)果與討論
因為本研究所檢測的真菌毒素種類較多,需要 兼顧各類目標待測物的提取效率。真菌毒素常用的 提取試劑有乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、正己 烷、二氯甲烷等,考察不同提取劑對目標物的提取效 果,其中甲醇、乙腈對各種真菌毒素均有較好的提取 效率,優(yōu)于其他幾種提取劑。乙腈為極性較強的低 毒溶劑,具有優(yōu)良的溶解性,對大多數(shù)非極性和部分 極性真菌毒素有較高的提取率,并可促使蛋白質(zhì)變 性沉淀,提高提取效率,因此本研究選用乙腈(或 乙腈體系)作為提取劑。部分真菌毒素對 pH、極性 范圍比較敏感,可在提取時加入輔助試劑增強聯(lián)合 提取效果,研究發(fā)現(xiàn)乙腈作為提取劑加入甲酸 可以提高伏馬毒素、赭曲霉毒素等的提取效果,經(jīng)過 實驗優(yōu)化最終選擇乙腈(含 2% 甲酸)作為提取液, 各種目標待測物均取得了良好的提取效果。采用空白樣品基質(zhì)溶液準確配制不同質(zhì)量濃度 的混合標準工作液,經(jīng)高分辨質(zhì)譜檢測,以色譜峰面 積(Y)為縱坐標、對照溶液的質(zhì)量濃度(X,μg / L) 為橫坐標繪制標準曲線。高分辨質(zhì)譜使用目標物的 精確質(zhì)量數(shù)提取,基線噪音很低,信噪比往往無窮 大,因此不采用以 3 倍信噪比(S / N)確定化合物檢 出限、10 倍信噪比確定化合物定量限(LOQ)的方 法,而是用向空白樣品中逐級降低加標濃度,以各目 標物在線性范圍中滿足回收率值在 60% ~ 120% 區(qū) 間內(nèi)的最低濃度為方法的定量限。結(jié)果表明,20 種 真菌毒素在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相 關(guān)系數(shù)(r2 )均>0. 99,定量限為 0. 25 ~ 20 μg / kg,可 滿足檢測要求。
3 結(jié)論
利用高效液相色譜-四極桿/ 靜電場軌道 阱高分辨質(zhì)譜,快速篩查和確證了糧谷產(chǎn)品中 20 種 真菌毒素。高分辨質(zhì)譜保證了復(fù)雜樣品中基質(zhì)干擾 的消除,顯著提高了目標物定性和定量結(jié)果的準確 性。該方法快速、靈敏、準確,可滿足糧谷產(chǎn)品中真 菌毒素的大通量快速篩查和確證。