越來越多的調(diào)查顯示,心血管疾病、癌癥、 糖尿病以及阿爾茲海默癥患者在逐年增加,而 引起這些疾病的主要原因是氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧 化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用的平衡被破壞, 從而產(chǎn)生過多的自由基,這被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和 疾病的一個(gè)重要影響因素。因此,抗氧化劑的研 究成為了近年來的熱點(diǎn)方向??寡趸氖翘烊豢?氧化劑的一種,有著良好的抗氧化性,可以有效 清除體內(nèi)多余的自由基,從而降低衰老和患病的風(fēng)險(xiǎn)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌種與培養(yǎng)基
植物乳桿菌(L. plantarum, LP)L60:實(shí)驗(yàn)室保藏;脫脂羊乳粉:富平縣秦源 乳業(yè)有限公司。 MRS肉湯培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0、酵母粉 4.0、磷酸氫二鉀2.0、乙酸鈉5.0、硫酸錳0.04、 牛肉膏8.0、葡萄糖20.0、檸檬酸氫二銨2.0、硫 酸鎂0.2、吐溫80 1.0,pH5.7±0.2,121 ℃滅菌15 min。 復(fù)原羊乳培養(yǎng)基:將脫脂羊乳粉與蒸餾水混 合配制成濃度為14%的復(fù)原羊乳,90 ℃滅菌15 min。 發(fā)酵培養(yǎng)基:復(fù)原羊乳14%,氯化鈉1.02%、 蛋白胨0.82%、葡萄糖0.72%,于90 ℃巴氏滅菌15 min。
1.1.2 主要試劑與儀器
氯化鈉:天津市富宇精細(xì) 化工有限公司;蛋白胨:北京奧博星生物技術(shù)有 限責(zé)任公司;葡萄糖:天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑 廠;Hip-His-Leu(HHL)、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋 白酶:美國Sigma公司;Alcalase:丹麥諾維信 公司。 JA6001電子分析天平:北京賽多利斯天平有 限公司;YX-280D手提式壓力蒸汽滅菌鍋:江陰 濱江醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-1F單人雙面超凈無菌操 作臺(tái):蘇州江東精密儀器有限公司;DH5000AB 電熱恒溫培養(yǎng)箱、DK-98-1電熱恒溫水浴鍋、 WG-71電熱鼓風(fēng)干燥箱:天津市泰斯特儀器有限 公司;BCD-254博西華冰箱:博西華家用電器有 限公司;UV-5300PC紫外分光光度計(jì):上海元析儀器有限公司;Q2-901漩渦混合儀:海門市其林貝爾儀器制造有限公司;OPTEC生物顯微鏡:重 慶奧特光學(xué)儀器有限公司;GT10-1臺(tái)式高速離心 機(jī):北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;PHS-3C酸度 計(jì):上海精科儀器公司。
1.2 方法
1.2.1 菌種活化
將L60凍干菌粉接種于滅菌MRS 肉湯培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化3代, 得到3代菌懸液。將3代菌懸液以5%的接種量接入 濃度為14%的復(fù)原羊乳培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng)至 凝乳,重復(fù)2次后保存于冰箱備用。 1.2.2 發(fā)酵羊乳制備 將蛋白酶按0.15%的添加量 加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 min后將活化后的L60接 種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,41 ℃恒溫培養(yǎng)至凝乳,置于 4 ℃冰箱冷藏備用。
1.2.3 待測(cè)乳清樣品制備
取一定量發(fā)酵羊乳于 100 mL燒杯中,測(cè)定其pH值。用濃度為1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵乳pH至3.4~3.6,8000 r/min離 心15 min并取其上清液;再用1 mol/L NaOH溶液 調(diào)節(jié)發(fā)酵乳pH至8.3,8000 r/min離心15 min,收集 上清液作為待測(cè)樣品。
1.2.4 OD值的測(cè)定
取1 mL發(fā)酵乳于50 mL燒杯 中,加入9 mL EDTA(0.2%)溶液,調(diào)節(jié)pH至12左 右,混勻,靜止5 min,以滅菌乳作為空白調(diào)零, 在640 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。
1.2.5 pH值的測(cè)定
測(cè)量前對(duì)PHS-3C酸度計(jì)進(jìn)行 標(biāo)定,然后取一定量發(fā)酵乳于100 mL燒杯中,使 用酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。
1.2.6 酸度的測(cè)定
使用氫氧化鈉滴定法,酸 度值用吉爾涅爾度(°T)表示。取5 mL發(fā)酵乳加入 到100 mL錐形瓶中,然后加入10 mL蒸餾水,并 滴加2~3滴酒精酚酞指示劑,混勻。用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定,不斷搖動(dòng),當(dāng)溶液中產(chǎn) 生微紅色并且在30 s內(nèi)不變色時(shí),結(jié)束滴定。記錄 消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)(V),乘以20即得 到100 mL發(fā)酵液的滴定酸度。
1.2.7 肽含量的測(cè)定
利用課題組前期繪制的肽標(biāo) 準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定。 取2.5 mL待測(cè)乳清樣液,加入2.5 mL 10%(w/ v)的TCA水溶液,混勻,靜置10 min,4000 r/min 離心15 min。收集上清液置于50 mL容量瓶中,以 5%的TCA溶液定容,然后取6.0 mL上述溶液于燒 杯中,加入4.0 mL雙縮脈充分混合,靜置10 min,2000 r/min離心10 min。收集上清液于540 nm下測(cè) 定吸光度,代入關(guān)系式,計(jì)算出肽濃度。
1.2.8 DPPH自由基清除率測(cè)定
將DPPH溶于95% 無水乙醇,配制0.l mmol/L DPPH自由基溶液。 將2 mL待測(cè)乳清樣品與8 mL DPPH自由基溶液混 勻作為試驗(yàn)組,2 mL乙醇溶液與8 mL DPPH自由 基溶液混勻作為對(duì)照組,2 mL待測(cè)乳清樣品與 8 mL乙醇溶液混勻作為空白組。
2 結(jié)果與討論
將單一蛋白酶(木瓜蛋白酶、Alcalase、風(fēng)味 蛋白酶)和復(fù)合蛋白酶(Alcalase和木瓜蛋白酶, Alcalase和風(fēng)味蛋白酶,Alcalase、風(fēng)味蛋白酶和 木瓜蛋白酶)分別按0.15%的添加量(復(fù)合酶等比例 添加)加入到于90 ℃滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中,酶解 30 min,然后按5%接種量接入L60,于41 ℃下開 始發(fā)酵,分別測(cè)定發(fā)酵0、4、8、12 h的pH值和滴 定酸度。將單一蛋白酶和復(fù)合蛋白酶分別按0.15%的添 加量添加到滅菌后的羊乳中,酶解30 min,然后 接入L60發(fā)酵,每隔4 h取樣測(cè)定其DPPH自由基清 除率,結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出,DPPH自 由基清除率并沒有表現(xiàn)出一定的規(guī)律性,4 h處添 加蛋白酶的發(fā)酵羊乳DPPH自由基清除率已有超過 對(duì)照組的,最大組為P+A組,DPPH自由基清除率 為71.1%,此時(shí)對(duì)照組為48.69%,說明可以通過 添加蛋白酶來縮短生產(chǎn)抗氧化肽的時(shí)間。8 h處, 除去A組,其他各組的DPPH清除率都有下降,可 能是由于菌體內(nèi)的肽酶使抗氧化肽進(jìn)一步水解。
3 結(jié)論
蛋白酶的添加,使發(fā)酵羊乳表現(xiàn)出了更高 的肽含量,這得益于蛋白酶較高的水解活性。 另外,添加蛋白酶顯著提高了植物乳桿菌L60發(fā) 酵羊乳的DPPH自由基清除率。DPPH自由基清 除率最大的是添加單一蛋白酶(木瓜蛋白酶),為 75.29%,對(duì)照組為70.02%。以上結(jié)果表明,添加 蛋白酶提高發(fā)酵脫脂羊乳的DPPH自由基清除率是 可行的,這將有助于生產(chǎn)具有高抗氧化性的功能 性發(fā)酵羊乳飲料。