阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種 神經(jīng)退行性疾病，以記憶障礙、失用、失認(rèn)、視空間 損害、執(zhí)行功能障礙及人格、行為異常為主要臨床表 現(xiàn)，主要病理表現(xiàn)包括腦萎縮、β-淀粉樣蛋白 （beta-amyloid protein，Aβ）沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、 神經(jīng)元及突觸丟失。2000－2013 年，AD 死亡人數(shù) 增加 71%，目前全球已有 4680 萬人患有 AD，預(yù)計(jì) 到 2050 年將增加到 1.315 億，AD 防治的全球成本 已占全球 GDP 的 0.65%。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性 SPF 級(jí) SD 大鼠 72 只，4 月齡，體質(zhì)量 250～ 300 g，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2014-0013。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方 醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度 （24±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，自由攝食飲 水，12 h/12 h 明暗交替。實(shí)驗(yàn)程序根據(jù) NIH《實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，該程序經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 藥物

天芪益智顆粒，北京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，批號(hào) 20140913；石杉?jí)A甲片，河南太龍藥業(yè)有限公司，批 號(hào) 140910A。

1.3 主要試劑與儀器

Aβ1-42（美國(guó) Sigma-Aldrich），TMT sixplex Label Reagent Set（美國(guó) Thermo Scientific Pierce），兔抗 Mdh2（Cell Signaling Technology，#8610），兔抗 Fadd （Abcam，ab124812），小鼠抗 β-actin（Santa Cruz， sc-47778），山羊抗小鼠 IgG-HRP（Santa Cruz， sc-2302），山羊抗兔 IgG-HRP（Santa Cruz，sc-2004）， RIPA 裂解液（Roche Diagnostics），ECL 試劑盒 （Amersham Pharmacia Biotech）。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 系統(tǒng)（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，DMS-2），渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），酶標(biāo) 儀（Thermo，Multiskan MK3），RIGOL L-3000 高效 液相色譜系統(tǒng)（北京普源精電科技有限公司）， GeneGnomeXRQ 生物成像系統(tǒng)（Syngene），高效液 相色譜儀（Thermo Scientic EASY-nLC 1000 System， Nano HPLC），質(zhì)譜系統(tǒng)（Thermo，Q-Exactive）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組

將實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、陽性藥組和天芪益智顆粒高、中、低劑量組，每 組 12 只。

2.2 造模

采用 Aβ1-42 微量注射法建立 AD 大鼠模型。操作步驟：將 Aβ1-42 溶解在六氟異丙 醇中至終濃度 4 μg/μL，4 ℃孵育 48 h 形成 Aβ1-42 寡聚體。大鼠腹腔注射 1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg） 麻醉，使用立體定向儀固定頭部，對(duì)手術(shù)區(qū)域消毒， 在顱骨中部縱向切口以暴露顱骨。分離骨膜后暴露頭 骨，于前囟后 3 mm、中線旁開 2.2 mm 處，用牙科鉆 打開顱骨，使用微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)針 3 mm，將 Aβ1-42 寡聚體溶液緩慢注入兩側(cè)海馬，注射時(shí)間 5 min，留 針 5 min。假手術(shù)組注射等體積無菌生理鹽水。

2.3 給藥

造模后 6 d 開始給藥，天芪益智顆粒高、中、低 劑量組分別給予 0.76、0.38、0.19 g/kg 天芪益智顆粒 藥液灌胃，陽性藥組給予 0.02 mg/kg 石杉?jí)A甲灌胃， 假手術(shù)組和模型組給予等量無菌生理鹽水灌胃。給藥 體積均為 0.5 mL/100 g，每日 1 次，連續(xù) 40 d。

2.4 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

采用 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組大鼠空間學(xué)習(xí) 和記憶能力。水迷宮由圓形水池、可移動(dòng)平臺(tái)和圖像 采集分析系統(tǒng)組成。實(shí)驗(yàn)前 1 d，將大鼠置于平臺(tái) 30 s 后使其入水，自由游泳 60 s 后，將其再次置于平臺(tái) 30 s。首先進(jìn)行可視平臺(tái)測(cè)試，平臺(tái)位于目標(biāo)象限并 使其頂部高于水面 2 cm，記錄大鼠找到平臺(tái)的逃避潛 伏期和總路程。定位巡航實(shí)驗(yàn)：目標(biāo)象限為第一象限， 平臺(tái)位于水面下 2 cm，實(shí)驗(yàn)連續(xù) 5 d，大鼠從除目標(biāo) 象限外的任一點(diǎn)入水，測(cè)定大鼠找到平臺(tái)的逃避潛伏 期?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：撤去平臺(tái)，將大鼠從除目標(biāo)象限 外的任一象限入水，測(cè)定大鼠穿越目標(biāo)象限的次數(shù)， 記錄其在目標(biāo)象限的停留時(shí)間。

2.5 TMT 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.5.1 樣品蛋白提取及胰酶酶解

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組和天芪益智顆粒高劑 量組大鼠腹腔注射 10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉并 處死，冰上快速分離腦組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗 干凈。每組分別隨機(jī)選取 3 只大鼠腦組織，將皮層 和海馬組織樣本中加入適量裂解液（8 mol/L 尿素， 100 mmol/L Tris，1×蛋白酶抑制劑，pH 8.5）中，渦 旋混勻，超聲破碎 5 min，使蛋白完全溶解，蛋白懸 浮液 4 ℃、15 000×g 離心 10 min，取上清分裝后凍 存于-80 ℃冰箱。采用 Bradford 法測(cè)定蛋白溶液的蛋 白濃度。使用胰蛋白酶進(jìn)行蛋白酶切，將酶切樣品溶液加入脫鹽柱中進(jìn)行脫鹽處理。

2.5.2 TMT 標(biāo)記

各組蛋白樣品脫鹽后，使用 TMT 標(biāo)記試劑盒進(jìn) 行標(biāo)記。標(biāo)記的樣品是大鼠的腦組織，從每組中隨機(jī) 選擇 3 只大鼠進(jìn)行生物學(xué)復(fù)制，將所有大鼠腦組織樣 品混合，用作重復(fù)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)。將 TEAB 緩沖液、TMT 標(biāo)簽和干粉狀態(tài)下的樣品從-20 ℃轉(zhuǎn)移至室溫下平 衡。制備 100 mmol/L TEAB 溶液。將單個(gè)樣品（不超 過 100 μg/TMT 標(biāo)簽）溶于 TEAB 緩沖液，充分混勻， 放置 10 min。每個(gè) TMT 試劑瓶中加入不高于 100 μL 蛋白樣品溶液，渦旋振蕩，孵育 1 h，向每個(gè)瓶中加 入 5%羥胺 8 μL 終止反應(yīng)，孵育 15 min。標(biāo)記結(jié)束后， 立即將蛋白樣品真空凍干，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br />
2.5.3 肽段混合及 LC-MS/MS 檢測(cè)

將混合標(biāo)記后的樣品用 100 μL 乙腈流動(dòng)相溶液 溶解，14 000×g 離心 20 min，取上清液，在高 pH 條 件下進(jìn)行反相色譜梯度分離。將分離得到的組分用 2%乙腈＋0.1%甲酸20 μL復(fù)溶。12 000×g離心10 min， 吸取上清液，采用夾心法上樣，上樣體積 10 μL。 質(zhì)譜分析時(shí)，噴霧電壓為 2.41 kV，毛細(xì)管溫度 為 25 ℃，離子源為 EASY-噴霧源，一級(jí)全掃掃描范 圍為 350～1600 m/z，分辨率為 70 000 FWHM，掃描 時(shí)間為 60 ms，二級(jí)圖譜掃描范圍為 350～1600 m/z， 分辨率為 17 500 FWHM，掃描時(shí)間為 70 ms。

2.5.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜分析由 Thermo Q-Exactive 型質(zhì)譜系統(tǒng)完成， 產(chǎn)生的質(zhì)譜原始文件采用 Thermo 公司的配套軟件 Proteome Discoverer 進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)庫的選擇以所需 物種、數(shù)據(jù)庫注釋完備性及序列可靠性為參考依據(jù)， 使用 UNIPROT Rat 數(shù)據(jù)庫，靜態(tài)修飾選擇甲酰胺甲 基化修飾，動(dòng)態(tài)修飾選擇氧化修飾。對(duì)組間原始數(shù)據(jù) 的 ratio 進(jìn)行過濾后，進(jìn)行 t 檢驗(yàn)，確定差異表達(dá)的蛋 白質(zhì)，進(jìn)行下一步分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s 表示，Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)果使 用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析，空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用 方差分析比較組間差異；蛋白質(zhì)定量分析使用 Student's t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析。P＜0.05 表示差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 天芪益智顆粒對(duì) Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫髮W(xué)習(xí)記憶能力的影響

定位巡航實(shí)驗(yàn)：隨訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠逃 避潛伏期均縮短。第 3～5 日，與假手術(shù)組比較，模 型組大鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和天芪益智顆 粒高、中、低劑量組大鼠逃避潛伏期縮短，部分時(shí)點(diǎn) 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。空間 探索實(shí)驗(yàn)：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在目標(biāo)象限 停留時(shí)間百分比和穿越目標(biāo)象限次數(shù)明顯減少，差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較， 陽性藥組和天芪益智顆粒高、中劑量組大鼠在目標(biāo)象 限停留時(shí)間百分比和穿越目標(biāo)象限次數(shù)均顯著增加， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

4.2 蛋白質(zhì)組差異蛋白鑒定結(jié)果

經(jīng) LC-MS/MS 檢測(cè)分析、蛋白數(shù)據(jù)庫檢索及組間 差異比較，成功鑒定出 33 個(gè)天芪益智顆粒高劑量組 與模型組差異蛋白質(zhì)。這些差異蛋白的功能與能量代謝、神經(jīng)信號(hào)傳遞、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、細(xì)胞凋亡、 蛋白質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞骨架等腦神經(jīng)細(xì)胞生理、病理過程 密切相關(guān)，其細(xì)胞定位包括線粒體、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、 細(xì)胞核、髓鞘、細(xì)胞骨架、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位。

4.3 差異蛋白 GO 功能分類結(jié)果

GO 分類結(jié)果顯示，這些差異蛋白分子功能涉及 蛋白結(jié)合活性、催化活性、受體活性、信號(hào)傳導(dǎo)活性、 結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性；生物學(xué)過程涉 及生物調(diào)節(jié)、生物合成、細(xì)胞過程、發(fā)育過程、細(xì)胞 定位、代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)等；細(xì)胞組分 包括大分子復(fù)合物、細(xì)胞膜、細(xì)胞器等； 信號(hào)通路涉及 ATP 合成、凋亡信號(hào)通路、RhoGTP 酶 對(duì)細(xì)胞骨架的調(diào)控、Fas 信號(hào)通路、谷氨酰胺-谷氨 酸轉(zhuǎn)化通路、糖酵解、三羧酸循環(huán)信號(hào)通路等。

5 討論

紅景天 藥，具有較 一種苯丙素 毒性、抑制 糖具有明顯 反應(yīng)等藥理 芪益智顆粒 用；TMT 蛋 能調(diào)節(jié) AD 水平；West 和 Fadd 的致。