刺梨( Ｒosa roxburghii Tratt) 又名茨梨，一種野生 小灌木，是西南地區(qū)常見的野生植被，成熟的刺梨果 實(shí)表面呈黃色且單寧酸含量高，含有大量的酚類化 合物，澀味重。刺梨樹是貴州省種植面積最大的野 生果樹資源，果實(shí)含有豐富的維生素 C、超氧化 物歧化酶( SOD) 、類黃酮、以及氨基酸等多種 有效物質(zhì)，在營養(yǎng)、保健和醫(yī)藥方面具有極高的研究 利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨 采自貴州省龍里縣刺梨種植基地; 紅 糖 市購; DNA 抽提試劑盒( E.Z.N.ATM Mag － Bind Soil DNA Kit) 美國歐米茄公司; Qubit3.0 DNA 檢測(cè) 試劑盒 美國生命技術(shù)公司; 2 × Taq Master Mix 南 京諾唯贊生物科技有限公司; MagicPure Size Selection DNA Beads 北京全式金生物科技有限公司; 細(xì)菌通 用引物( 341F，805Ｒ) 生工生物工程( 上海) 股份有 限公司。 Pico－ 21 臺(tái)式離心機(jī) 賽默飛世爾科技公司; 其林貝爾GL-88B漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司; TND03－H－H 混勻型干式恒溫器 深圳拓能 達(dá)科技有限公司; DYY－6C 電泳儀電源、DYCZ－21 電 泳槽 北京市六一儀器廠; 凝膠成像系統(tǒng) 美國 UVP; T100TM Thermal Cyele PCＲ 儀 美國伯樂公 司; Q32866Qubit  3.0 熒光計(jì) 美國英杰生命技術(shù) 有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 刺梨發(fā)酵液制備

先將 10 L 的白色塑料桶用 75% 的酒精經(jīng)表面殺菌后備用，將榨汁后( 刺梨果出 汁率約為 60% ) 的刺梨果粉碎，參照朱麗梅等方 法，將刺梨果渣、水、紅糖按質(zhì)量比 3∶ 10∶ 1裝在塑料 桶中，搖勻，密封發(fā)酵，每隔 6 d 放一次氣攪拌并取 樣，連續(xù)發(fā)酵 60 d。

1.2.2 樣品總 DNA 的提取

樣品前處理: 取 2 mL 發(fā) 酵液樣品，加入到已滅菌的離心管中，在 10000 r /min 離心 3 min，棄上層液，沉淀倒置吸水 紙 上 1 min， 濾干。 樣品總 DNA 的提取: 具體提取步驟參照試劑盒 使用說明書操作，然后再利用 1% 瓊脂糖凝膠檢測(cè) DNA 完整性，再進(jìn)行下一步分析。

1.2.3 細(xì)菌

16S rDNA 基因 PCＲ 擴(kuò)增 利用 DNA 檢 測(cè)試劑盒對(duì)基因組 DNA 精確定量，以確定 PCＲ 反應(yīng) 需要加入的 DNA 量。PCＲ 所用的引物已經(jīng)融合了 Miseq 測(cè) 序 平 臺(tái) 的 V3 － V4 通 用 引 物 ( 341F， 805Ｒ) 。 將配置好的 PCＲ 體系( 30 μL 體系) 按照下列條 件進(jìn)行 PCＲ 擴(kuò)增: 94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性處理 30 s，45 ℃退火 20 s，65 ℃延伸 30 s，5 個(gè)循環(huán); 94 ℃ 變性處理 20 s，55 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 30 s，20 個(gè) 循環(huán)，72 ℃ 延伸 5 min。PCＲ 結(jié)束后進(jìn)行第二輪擴(kuò) 增，引入 Illumina 橋式 PCＲ 兼容引物，配置好的 PCＲ 體系( 30 μL 體系) 按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行 PCＲ 擴(kuò) 增: 95 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃ 變性處理 20 s，55 ℃ 退 火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，5 個(gè)循環(huán); 72 ℃ 延伸 5 min， 降溫到 10 ℃。擴(kuò)增完成后，回收 PCＲ 產(chǎn)物并純化。

1.2.4 Illumina MiSeq 高通量測(cè)序

將所得到的 PCＲ 產(chǎn)物送往生工生物工程( 上海) 股份有限公司進(jìn)行高 通量建庫和細(xì)菌多樣性分析。測(cè)序完成后進(jìn)行 DNA 序列拼接和質(zhì)量控制，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行生物學(xué)信 息分析。

1.2.5 多樣性分析

根據(jù) OTU 聚類分析的結(jié)果，采 用 Mothur 在 OTU 相似水平在 97% 的條件下計(jì)算多 樣性指數(shù)，包括 OTU 數(shù)量、香農(nóng)指數(shù)、Chao1 指數(shù)、森 普森指數(shù)、Ace 指數(shù)和覆蓋率指數(shù)。

1.2.6 群落組成分析

利用 blastn 將 OTU 序列與相 應(yīng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，觀測(cè)樣品在不同分類水平上的 群落結(jié)構(gòu)，篩選出 OTU 序列的最適比對(duì)結(jié)果并在默 認(rèn)滿足相似度 ＞ 90% 的基礎(chǔ)上，選取不同分類水平 上的細(xì)菌群落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)分析結(jié)果，利用軟 件繪制所有樣本群落結(jié)構(gòu)分布柱狀圖、物種可視化 圈圖等進(jìn)行群落組成分析。 1.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理采用 Ｒ 語言和 mothur( https: / /mothur. org /wiki /Chao /Ace / Shannon / Simpson /Coverage ) 軟 件 進(jìn) 行 分 析，利 用 cutadapt ( https: / / pypi.org / project / cutadapt /1.2.1 /) 去 除 接 頭，PEAＲ ( https: / /cme.h －its.org /exelixis /web / software / pear /) 進(jìn) 行 序 列 對(duì) 拼， Prinseq ( http: / / prinseq.sourceforge.net /) 質(zhì) 量 剪 切。 測(cè)序獲得的基因序列與 Silva ( http: / /www.arb － silva.de /) 、NCBI 16S( http: / / ncbi.nlm.nih.gov /) 、ＲDP ( http: / / rdp.cme.msu.edu /misc / resources.jsp) 數(shù) 據(jù) 庫 進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)如表 2 所示，刺梨果渣在 分別發(fā)酵 6、12、18、24、30、36、42、48、54 和 60 d 時(shí)間 點(diǎn)上，10 個(gè)樣品的 OTU 數(shù)量和 ACE 指數(shù)在發(fā)酵 6 和 12 d 總體變化不大; ACE 指數(shù)用來估計(jì)群落中 OTU 數(shù)目的指數(shù)，ACE 指數(shù)在 12 和 18 d 值較大，表明了 12～18 d 隨著發(fā)酵的進(jìn)行發(fā)酵刺梨果渣中細(xì)菌群落 豐度逐漸增大; 發(fā)酵 24 d 以后樣本中的 OTU 數(shù)量和ACE 指數(shù)開始下降; 在發(fā)酵 54 d 時(shí) ACE 指數(shù)最大， 達(dá) 1311.29，說明發(fā)酵到第 54 d 時(shí)已達(dá)到發(fā)酵的最高 時(shí)期，發(fā)酵最后 60 d 物種多樣性開始下降。香農(nóng)指 數(shù)用來反映微生物多樣性，指數(shù)越大，群落多樣性越 高，對(duì) 10 個(gè)樣本中的香農(nóng)指數(shù)隨著發(fā)酵時(shí)間的變化 可知，在發(fā)酵 6 d 時(shí)香農(nóng)指數(shù)較高，其次是 12 d，表明 剛開始發(fā)酵到 12 d 時(shí)，刺梨果渣中細(xì)菌群落多樣性 逐漸增高，其余發(fā)酵時(shí)間香農(nóng)指數(shù)相對(duì)較穩(wěn)定。森 普森指數(shù)用于估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，森普森指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低，由，發(fā)酵到 18 d 時(shí)樣本多樣性最低。發(fā)酵過程中 10 個(gè)樣本的覆蓋率均在 99% 以上，甚至在發(fā)酵 18、24、 和30 d 時(shí)覆蓋率達(dá)100% ，表明了測(cè)序的數(shù)據(jù)能夠覆 蓋目前狀態(tài)下樣品中的細(xì)菌種類，測(cè)序量已經(jīng)達(dá)到 最大值，能夠真實(shí)映射樣本中的細(xì)菌群落情況，可以 用于后續(xù)的分析。Chao1 指數(shù)在發(fā)酵前 6、12 和 18 d 時(shí)值最高，一般 Chao1 指數(shù)在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì) 物種總數(shù)，細(xì)菌群落物種總數(shù)最高，說明該階段的細(xì) 菌群落最豐富; 后期 Chao1 指數(shù)趨于穩(wěn)定，表明發(fā)酵 后期細(xì)菌群落物種趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)貴州省龍里縣刺梨 種植基地的刺梨果渣在自然發(fā)酵過程中( 0～60 d) 的 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析，分析共檢測(cè)出 26 個(gè)門類、40 個(gè)綱類群、74 個(gè)目類群、162 個(gè)科類群、373 個(gè)屬類群。在整個(gè)發(fā)酵過程中，主要以葡糖桿菌 屬和醋酸桿菌屬為主。雖然發(fā)酵后期葡糖桿菌屬和 醋酸菌屬大量生長(zhǎng)繁殖，成為整個(gè)發(fā)酵過程中的優(yōu) 勢(shì)菌群，使其它細(xì)菌相對(duì)豐度降低，但這些菌群在發(fā) 酵過程中一直存在，所以總體上細(xì)菌的多樣性變化 趨勢(shì)并不大，這很大程度上有可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程 一直處于密封環(huán)境中，容器中的微量氧氣慢慢被消 耗，發(fā)酵后期逐漸形成厭氧環(huán)境，微好氧菌快速繁 殖，抑制其它菌群生長(zhǎng)，使菌群中比例占優(yōu)勢(shì)的好氧 菌大量減少而造成的。



 

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