惡性膠質(zhì)瘤發(fā)病快，70% ～80%的患者多在發(fā)病 半年之內(nèi)確診 。隨著醫(yī)療技術(shù)及新藥研發(fā)加 快，針對膠質(zhì)瘤的治療手段取得較大進(jìn)步，療效亦有 明顯提升，但現(xiàn)實(shí)仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，膠質(zhì)瘤患者的 預(yù)后和存活依然沒有得到顯著改善，加強(qiáng)膠質(zhì)瘤 發(fā)病機(jī)制研究和治療方法探索顯得極為緊要，開發(fā) 新的藥物用于治療膠質(zhì)瘤對于提高患者療效和預(yù)后 具有重要意義，蒙藥巴特日七又名為巴布敦朱日，是蒙醫(yī)臨床上治療黏熱癥及腸刺痛的最常用方劑。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料

U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞購自中國科學(xué)院 上海生物學(xué)研究所。SPF 級雄性 C57BL /6 小鼠，來 源北京維通利華動物實(shí)驗(yàn)中心。

1. 2 試劑

巴特日七味丸( 內(nèi)蒙古蒙藥股份有限 公司) 。胎牛血清購自 Gibco 公司，DMEM 培養(yǎng)基、 胰蛋白酶購自美國 Invitrogen 公司，PAMAM 和 FA 購自美國 Sigma 公司。兔抗小鼠的高遷移率族蛋白 ( HMG) B1、Toll 樣受體( TLＲ) 4、核因子( NF) -κB 和 β-actin 多克隆抗體購自美國 Abcam 公司; 辣根過氧 化物酶耦聯(lián)山羊抗兔 IgG 購自北京中杉金橋生物技 術(shù)有限公司; 聚偏氟乙烯( PVDF) 、聚氰基丙烯酸正 丁酯( BCA) 蛋白定量試劑盒、電光學(xué)發(fā)光( ECL) 顯 色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。ＲIPA 裂 解液、Trizol 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科 技北京有限公司) ，SYBＲ Premix Ex TaqTM Ⅱ購自 寶日生物技術(shù)北京有限公司，引物由上海生工生物 合成，Applied Biosystem 7500 快 速 熒 光 定 量 PCＲ 儀。垂直電泳槽和電轉(zhuǎn)儀購自北京六一儀器廠，水平搖床購自江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1. 3 實(shí)驗(yàn)方法

1. 3. 1 小鼠膠質(zhì)瘤模型構(gòu)建

取對數(shù)生長期 U251 細(xì)胞，胰蛋白酶消化，離心去上清，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，磷酸 鹽緩沖液( PBS) 重懸，置于 37℃ 水浴備用。麻醉小 鼠，將小鼠固定于立體定向儀上，剪去頭頂部眼裂至 外耳道之間的毛發(fā)，常規(guī)消毒鋪單，于中線處眼裂后 作一長 約1. 0 cm 垂 直 切 口，暴 露 前 囟，取 其 前 方 1. 0 mm，右側(cè)距中線 1. 0 mm 處鉆孔，其直徑約為 1. 0 mm，用微量注射器吸取 4 μl 細(xì)胞懸液，調(diào)整移 動架位置，使針尖位于骨孔處，緩慢垂直進(jìn)針，持續(xù) 注射 10 min，緩慢拔針，以骨蠟封閉骨窗，逐層縫合 關(guān)顱，固定于電極移動架上。正常飼養(yǎng)( 57BL /6 小 鼠作為對照組) 。

1. 3. 2 治療方法

將模型分為四組: 對照組注射無 菌生 理 鹽 水; 低劑量治療組注射巴特日七味丸 20 mg /kg; 中劑量治療組 注射巴特日七味丸 40 mg /kg; 高劑量治療組 注射巴特日七味丸80 mg /kg，每組 20 只。每天灌胃給藥 1 次，每隔 1 d 測量腫瘤變化，治療 12 d，脫臼處死，取腫瘤組織，并 取出腫瘤稱重記錄，計(jì)算腫瘤體積，計(jì)算抑瘤率，體 積抑瘤率( %) = ( 實(shí)驗(yàn)組平均瘤體積/模型組平均瘤 體積) ×100%。腫瘤組織一部分用甲醛溶液保存， 一部分放入液氮保存。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。

1. 3. 3 腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況

TUNEL 法檢測腫 瘤細(xì)胞凋亡情況，將制備好石蠟切片按試劑盒說明 書進(jìn)行操作，于光鏡下觀察，若細(xì)胞核內(nèi)為棕黃色即 為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選擇并計(jì)算 5 個(gè)高倍視野中凋亡 指數(shù)( AI) 。AI = ( 凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)) ×100%。

1. 3. 4 Western 印跡檢測

HMGB1、TLＲ4、NF-κB 蛋 白 水 平 解 凍 組 織，加 ＲIPA 裂 解 液 裂 解， 12 000 r/min，4℃，離心 30 min，取上清。采用 BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，上樣 50 g，根據(jù)濃度 計(jì)算各個(gè)樣品所需體積，按 1 ∶5加上樣緩沖液，隨后 進(jìn)行 電 泳，電 泳 完 成 后，切 膠。隨 后 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 膜， 200 mA，120 min。5%的脫脂牛奶封閉，室溫水平搖 床 2 h。用封閉液稀釋相應(yīng)的 HMGB1、TLＲ4 和 NF-κB一抗，使 PVDF 膜浸泡于 TBST 中，4℃ 孵育過 夜。PBST 洗 3 次，每 次 5 min，辣根過氧化物酶 ( HＲP) 標(biāo)記二抗按 1 ∶50 000 稀釋，孵育 HＲP 標(biāo)記 的二抗，PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，室溫?fù)u床孵 育 2 h。TBST 清洗 PVDF 膜 3 次，5 min /次。加入 ECL 底物液，孵育 3 min。放入顯影液顯影、定影液 定影。采用 IMAJ 軟件對目標(biāo)圖像進(jìn)行灰度值分 析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

TUNEL 法檢測結(jié)果顯 示，模 型 組 AI 為 〔( 10． 64 ± 1． 36) %〕，與 對 照 組 〔( 41．25±5．16) %〕相比，明顯降低( P＜0．05) ，蒙藥 巴特日七治療后，AI 明顯增加，且隨著劑量的增加， AI 增加越明顯〔低劑量組( 18．13±2．29) %，中劑量 組( 25．36±3．15) %，高劑量組( 33．52±4．28) %，P＜0． 05〕。ＲT-qPCＲ 結(jié)果結(jié)果顯示，與模型組相比，HMGB1、TLＲ4、NFκB mＲNA 表達(dá)水平明顯增加( P＜0．05) ，蒙藥巴特 日七治療后三種 mＲNA 明顯減弱，且隨著劑量增 加，mＲNA 減 弱 越 明 顯，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān) 系 ( P ＜ 0．05)。

3 討 論

膠質(zhì)細(xì)胞瘤在手術(shù)中徹底切除腫瘤存在較大困 難。故膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率高和預(yù)后較差。放化療法能夠 殺死膠質(zhì)瘤細(xì)胞，但其不具特異性，故會造成嚴(yán)重副 反應(yīng)，目前尚不明確發(fā)病機(jī)制，臨床上尚未具備根本 治療的方法。因此，尋找新的有效的治療藥物仍然 至關(guān)重要 。蒙藥治療腫瘤具有獨(dú)特優(yōu)勢，用藥 少，其療效好且安全性較高，且毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)， 在抗腫瘤作用機(jī)制的研究逐漸成為醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)。蒙藥 巴特日七味丸具有清熱解毒、消黏的功效，為腸道及 黏熱癥的常用主方，鄧秀玲研究顯示蒙藥巴特日 七能抑制 MGC-803 細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，蒙藥巴 特日七味丸呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系地抑制裸鼠移植瘤的 生長 。腫瘤細(xì)胞之所以可無限增殖和生長。

 

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