1 材料與方法 

1. 1 材料與試劑

 20份油菜薹（甘藍(lán)型油菜，Brassica napus L.）樣 品采摘自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所試驗(yàn)基 地，其它蔬菜小白菜（上海青，B. rapa spp. chinen? sis）、西蘭花（B. oleracea var. Italic Planch）和結(jié)球甘 藍(lán)（B. oleracea var. capitata）購買自實(shí)驗(yàn)室周邊5個(gè) 超市和蔬菜市場。順式維生素K1、反式維生素K1和 維生素 K1-D7 標(biāo)準(zhǔn)品購自加拿大 Toronto Research Chemicals公司；甲醇（色譜純）：賽默飛世爾科技（中 國）有限公司；正己烷（色譜純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑 有限公司；乙酸乙酯（色譜級(jí)）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；異丙醇：德國默克股份兩合公司； 甲酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸銨： 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Mega Bond Elut AL-N：美國Agilent公司；Mega BE-SI：美國Agi? lent 公司；Hicapt Benzo：維泰克科技（武漢）有限公 司 ；DIKMA ProElut C18：迪馬科技 ；Simon Aldrich PCX：德國 Simon Aldrich 公司 ；Sep-Pak Vac Silica Cartridges：美國 Waters 公司；DIKMA ProElut SI：迪 馬科技；Waters WCX：美國Waters 公司。

1. 2 儀器與設(shè)備

Waters YMC C30液相色譜柱（150 mm×4. 6 mm× 3 μm）：日本YMC株式會(huì)社；液相色譜三重四級(jí)桿串 聯(lián)質(zhì)譜儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；3205 食品加工機(jī)：德國 Braun 公司（產(chǎn)地：匈牙利）；AUW220D 電子分析天平：日本島津公司；移液槍（100 μL、200 μL、1 mL、5 mL）：德國 Eppendorf 公司；XHC旋渦混勻器：常州未來儀器制造有限公司；HITA? CHI CT6E 離心機(jī)：日本日立有限公司；DTC-27J 超 聲波水浴鍋：中國湖北鼎泰生化技術(shù)設(shè)備制造有限 公司；BCD-260WDBD型冰箱：青島海爾股份有限公 司；Test Tube Shaker KB-5010 搖床：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；BF-2000型氮?dú)獯蹈蓛x：北京 八方世紀(jì)科技有限公司；50 mL具塞離心管：美國康 寧公司；10 mL 具塞離心管：中國上海貿(mào)易公司；一 次性無菌注射器：武漢市王冠醫(yī)療器械有限責(zé)任公 司；0. 22 μm 有機(jī)系濾膜：美國 Millipore 公司；250 μL玻璃內(nèi)襯管：安捷倫科技有限公司；1. 5 mL進(jìn)樣 小瓶：美國Agilent公司。

1. 3 方法

1. 3. 1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品順式維 生素K1、反式維生素K1各50 mg于深棕色玻璃瓶中， 分別用色譜級(jí)甲醇溶解，定容至10 mL，混合均勻配 制成5 mg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。 準(zhǔn)確稱取1 mg維生素K1-D7同位素標(biāo)準(zhǔn)品于深 棕色玻璃瓶中，加入甲醇定容至10 mL，混合均勻配 制成 100 μg/mL 的維生素 K1-D7 同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備 溶液。 使用移液槍準(zhǔn)確移取母液于棕色瓶中，加入純 甲醇進(jìn)行逐級(jí)稀釋，配制成所需不同濃度的單一標(biāo) 準(zhǔn)品溶液以及混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（不同濃度的混合標(biāo) 準(zhǔn) 品 溶 液 均 含 有 50 ng/mL 維 生 素 K1-D7 ），儲(chǔ) 存 于-20℃冰箱中，備用。

1. 3. 2 樣品制備、提取及測定

樣品應(yīng)新鮮，洗凈 后，擦去表面水分，用食品加工機(jī)制成勻漿保存于 冰箱待用，用時(shí)置于室溫下解凍。 準(zhǔn)確稱取 0. 5 g 蔬菜勻漿樣品于 50 mL 具塞離 心管中，加入 250 ng的同位素內(nèi)標(biāo)維生素 K1-D7，加 入5 mL異丙醇，渦旋混勻后超聲5 min。加入10 mL 正己烷，渦旋振蕩 10 min，然后以 4500 r/min 轉(zhuǎn)速離 心6 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL具塞離心管中。再 向下層溶液加入 10 mL 正己烷重復(fù)提取一次，在渦 旋混勻器上將沉淀旋開，振搖 10 min 后，以 4500 r/ min轉(zhuǎn)速離心6 min。合并上清液，正己烷定容至25 mL。然后用移液槍移取 5 mL 上清液于 10 mL 試管 中，氮?dú)獯蹈珊蠹尤? mL正己烷溶解，待凈化。 中性氧化鋁柱用5 mL正己烷活化后，將上述正己烷復(fù)溶的1 mL提取液以1. 0 mL/min流速過柱，用 5 mL 正己烷以 1. 0 mL/min 流速淋洗小柱，最后用 8 mL正己烷：乙酸乙酯（80:20，V:V）溶液洗脫至10 mL 試管中，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?1 mL 甲醇復(fù)溶，經(jīng) 0. 22 μm 有機(jī)濾膜過濾至 1. 5 mL 進(jìn)樣小瓶中，待 HPLCMS/MS分析。

2 結(jié)果與分析

油菜薹等蔬菜屬于低脂性樣品，但樣品中葉綠 素、類胡蘿卜等干擾物質(zhì)含量較高，因此，檢測前需 選取合適的固相萃取柱對提取液進(jìn)行凈化。本文 考察了 DIKMA ProElut C18，Waters WCX，Simon Al? drich PCX，Hicapt Benzo，DIKMA ProElut SI，Mega BE-SI，Sep-Pak Vac Silica Cartridges，Mega Bond Elut AL-N 8種常用的固相萃取柱?？疾?種SPE柱 對正己烷提取液的凈化效果。圖 1 結(jié)果表明，中性 氧化鋁柱（圖 1中第 5個(gè)柱）對蔬菜基質(zhì)的凈化效果 明顯優(yōu)于其它7種固相萃取柱。中性氧化鋁柱洗脫 液顏色較淺，進(jìn)一步說明其吸附葉綠素等干擾物質(zhì) 能力強(qiáng)，凈化效果好。中性氧化鋁柱用于保留或去 除極性化合物，適用于醛、酮、醌和硝基化合物以及 在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定的物質(zhì)的分離，因此，選擇中 性氧化鋁柱用于維生素K1的凈化分析。

3 討論

建立了油菜薹中維生素 K1順反異構(gòu)體的分析 檢測方法。采用異丙醇和正己烷對油菜薹樣品進(jìn) 行提取后，再用氧化鋁固相萃取柱凈化，能有效分 離維生素 K1，凈化除去葉綠素、類胡蘿卜素等干擾 物。選用維生素 K1-D7同位素作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量， 可有效消除基質(zhì)效應(yīng)，提高回收率和檢測靈敏度。 通過 HPLC-MS/MS 選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（SRM）,可以 降低噪音和基質(zhì)背景，提高檢測的靈敏度。與國標(biāo) 法相比本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了利用 C30色譜柱對順反式維生 素 K1進(jìn)行分離。本方法中順式維生素 K1和反式維 生素 K1的檢出限分別為 0. 49 μg/kg、0. 29 μg/kg，定 量限分別為 1. 63 μg/kg、0. 95 μg/kg，相關(guān)系數(shù)均≥ 0. 9978，加標(biāo)回收率在 87. 5%～117. 6% 之間，精密 度（RSD）在0. 72%～9. 59%之間。該方法樣品富集 凈化操作簡單、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，能夠滿足蔬菜 中維生素 K1順反異構(gòu)體的檢測。

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